之前不是说我的lip迟迟做不出来嘛，在修正了引物之后我已经做了两轮了，依旧不成，两轮我设置了不同的连接比例，而且一个板子上挑12个点去screening，这就不是连接效率的挑点问题了，我实在是想不明白，于是就盯着我的试验记录开始从头捋。在回顾的过程中，我发现pcr出片段的长度似乎比理论值短一些，在的下边一点，但这也不排除它其实不短，因为跑出的maker它和的条带本身有点粘在一起了（所以每一步都很重要，现在排查问题都不能确保不是pcr片段的问题。不过，模板错的概率很小，而且要错是拿错样品的概率，这都标签写着呢，除非师兄制文库的时候搞错了，但这个概率其实很小，因为他的确是一个有条理的人。当然，不能迷信一个人，也不能完全排除模板问题，于是师兄又给了我另一管模板，但鉴于概率很小，我暂且没有从头PCR，只是先收着了模板，以作最后不得已的后手。）也得亏我有坚持用幕布做实验记录，把每天做了什么，每一步的结果图都整理保存了，这也是电子试验记录的一个好处，就是可以客观而非主观回忆去复盘结果判读，因为当时我就很担心自己对于结果不能做出正确的判断，这样带图客观地记录，也是我在上次用“错”参考答案中吸取的经验。于是就跳过模板接着往后查找原因，师兄也帮我一起看，他提出了一个我没有想到的角度---可能是酶不好用了。我之前从来没有考虑过试剂的问题，但其实生化实验恰恰很依赖试剂，尤其是这种极其微量的。当时我一听到心里就咯噔一声，或许真的是Xhol酶的问题。因为我之前试图用单酶切来做，lip就是选用的Xhol，没有做出来，而KIF那组的六个都用单酶切方法做出来了，KIF的六个选择的酶是EcoRI，当时我并没有往这上边想，而师兄也从来没有用过单酶切，他一直都用双酶切或直接P环同源重组，所以当时他说单酶切有自连的风险，可能载体切开之后粘性末端又自连了。出于不同的原因，我们谁也没有重视并发现这个事情。酶的问题他之前跟我讲过，说结冰的酶就不要用了，我也有记住，但是那一堆的连接酶试管都冻在冰盒了，没办法单独拿出来，而我直接从冰箱里拿出冰盒来就可以吸出来酶液，于是我默认它没有结冰。师兄用钳子把酶管夹出来，它的确部分结冰了，正常情况下，酶液是不会在-20°C结冰的，就是这样意想不到的小细节。这是一个很宝贵的经验，对老手来说。至少对我来说，我需要确保自己每一步的操作都没有错才可以去猜想这个事情，因为新手的问题往往处在自己身上。师兄从库存里拿了新的酶给我，今天重新酶切了，重连重转，明天一早又可以screening了，我直觉明天可以的（可真是把孩子盼望疯了）。说到从冰盒里拔酶管，当时师兄用钳子夹，夹碎了管子，冰块带着管子四处飞溅，直接砸在了我的额头上，师兄当时下意识把手伸出来护着我，我当时脑子里冒出的是什么你知道吗，我当时想的是，他以后肯定会是个好爸爸，因为在那一刻我感受到了父爱。超奇怪，我有时候真的会想称呼他和师姐“我爸我妈”，不是开玩笑，我敢保证以后他们的小孩也会有我那一刻的感受，那种被保护的安全感。太搞笑了，当时被蹦到之后，我继续站在那里看酶管，总觉得下一秒他可能会说“去，让你师姐看看（你的伤）”，你脑补一下爸爸带着小孩出去玩摔倒了然后找妈妈上药的那种场景，请以此想象我有多想加入他们这个家庭。hahhhhhh说实话，我很羡慕，感觉他们是细水长流的平淡隽永，今天实验室另一个师兄请大家吃二胎席，师姐师兄两个人一起包的红包，师姐说“这是我和g哥的心意，希望小孩健康幸福”。当时我就站在旁边，仿佛他们已经一起生活了很多很多年了，身边所有人都默认他们两个是一个整体了，看到其中一个就会想到另一个，像看到锁就会想到它属于一把钥匙一样自然。嗯，又是为实验殚精竭虑的一天，又是为别人爱情感叹的一天。不过话说今天去吃了海鲜大餐，借着新出生小宝贝的光出去放风，感觉外边的空气呼吸起来都不一样，疫情那么久了，深圳总算逐渐地复原了，一切都会逐渐变好，恢复它本来的样子---向更好发展的样子。文末，祝小宝贝健康平安，茁壮成长。王檀央
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